Идентификация возбудителей нозематоза пчел методом ПЦР «в реальном времени»

Нозематоз - заболевание взрослых пчел, маток и трутней, вызываемое микроспоридией рода Nozema, паразитирующей в эпителиальных клетках средней кишки. 
В настоящее время во многих странах мира отмечается нарастание гибели пчел от нозематоза. Сейчас выделено два возбудителя данного заболевания – это давно известная Nosema apis (Zander, 1909) и сравнительно недавно изученная Nosema ceranae (Fries et al., 1996).

Следует отметить, что долгие годы микроспории рода Nosema относили к типу простейших, а заболевание нозематоз относили к инвазиям. Современная систематика относит возбудителей нозематоза к царству грибов, а заболевание нозематоз не к инвазиям, а к инфекциям.

Молниеносный коллапс (синдром массовой гибели пчел) многие исследователи связывают именно с поражением пчел микроспоридией Nosema ceranae. Опасность заключается в том, что нозематозная инфекция медоносных пчел, вызываемая Nosema ceranae, в начальной стадии не имеет явно выраженных клинических признаков, характерных для нозематоза. Зачастую болезнь проявляется в замедлении развития пчелиных семей, незначительном расстройстве пищеварения пчел весной и осенью. Гибель пчел происходит, как правило, внезапно осенью при  достаточных кормовых запасах в ульях.

Лабораторная идентификация возбудителей нозематоза затруднена, так как морфологические различия незначительны и не могут быть установлены при использовании традиционных методов исследования.

Для идентификации спор ноземы необходимо применять специальные методы исследования: электронную микроскопию или разработанные в последние годы и широко применяемые молекулярно-генетические методы, в частности, полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Для идентификации спор Nosema ceranae и Nosema apis за рубежом в настоящее время наиболее часто применяется ПЦР в различные модификациях.

Метод ПЦР для идентификации спор ноземы в нашей стране был разработан СО ВНИИ ветеринарной энтомологии и аранхологии РАСХН совместно с НИИ защиты растений РАСХН в 2010 г. (Ю.С. Токарев, А.Н. Игнатьева, З.Я. Зинатулина). Авторы сообщают о идентификации микроспоридий, выделенных из пчел Тюменской области, как Nosema apis.

Сведений об обнаружении Nosema ceranae в семьях медоносных пчел, больных нозематозом, на территории  РФ в доступной нам литературе мы не нашли. Для видовой идентификации спор ноземы, нами был разработан метод ПЦР «в реальном времени», который в сравнении с традиционным методом, имеет ряд преимуществ.

На экспериментальной пасеке ГНУ ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН, используя обычную световую микроскопию, было выявлено 4 семьи пчел пораженных нозематозом и сформирована опытная группа. В качестве контроля использовали пчел от здоровых семей. От опытных и контрольных семей были отобрано по 50 живых пчел из средней кишки которых выделяли ДНК и проводили ПЦР «в реальном времени».

Наиболее ответственным этапом при постановке реакции ПЦР «в реальном времени» является синтез праймера. Необходимая информация о последовательности нуклеотидов у микроспоридий Nosema apis и Nosema ceranae получена из международных банков данных (GenBank, EMBL).

Учет результатов проводили по анализу кривых накопления ДНК в ходе проведения ПЦР «в реальном времени». В качестве контроля использовали электрофорез.

При анализе содержания ДНК двух возбудителей нозематоза пчел методом ПЦР «в реальном времени» установили, что содержание ДНК Nosema ceranae существенно выше, чем содержание ДНК Nosema apis в средней кишке пораженных нозематозом пчел. Визуально это видно по выходу ПЦР-продукта (ампликона), а так же по кривым ПЦР «в реальном времени». О высоком содержании генома Nosema ceranae свидетельствуют и незначительные изменения концентрации ампликона в экспериментах с разведением ДНК- матрицы. При разведении в 10000 раз выход ампликона практически не меняется при визуальном анализе в геле. В результате экспериментальных исследований по выделению ДНК у пораженных нозематозом пчел с применением ПЦР «в реальном времени» было установлено, что основным возбудителем нозематозной инфекции на экспериментальной пасеке ГНУ ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН является микроспоридия вида Nosema ceranae.

Следующим этапом нашей работы было изучение влияния вида Nosema ceranae на жизнедейтельностью и продуктивность пчелиных семей. Так как по литературным данным именно этот вид ноземы по мнению многих за рубежных исследователей является более патогенным и приводит к массовой гибели и слету пчел.

С этой целью в течение пчеловодного сезона в опытных и контрольных семьях пчел выполнялись все необходимые пасечные работы, при этом лекарственные средства, стимуляторы развития, специальные пчеловодные приемы не применялись.

Результаты наблюдений свидетельствуют о том, что вид Nosema ceranae отрицательно влияет на жизнедеятельность и продуктивность пчелиных семей, так сила семей опытной группы пчел была в среднем на 36,7% больше, а количество собранного ими меда на 32,8% меньше чем в контроле. При этом массовой гибели и слета пчел не отмечено. Следует отметить, что полученные нами данные не совпадают с данными зарубежных авторов.